Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Лаборатория фитосанитарной диагностики и прогнозов

МЕТОДЫ МОНИТОРИНГА И ПРОГНОЗА РАЗВИТИЯ ВРЕДНЫХ ОРГАНИЗМОВ

МЕТОДЫ МОНИТОРИНГА АНТРАКНОЗА ЛЮПИНА*

Общие сведения

Антракноз люпина в России появился в конце 80-х годов и в настоящее время распространился практически во все районы, где выращивается культура. Развитие антракноза на люпине снижает урожайность зеленой массы и зерна, по нашим данным, на 30-50%, в эпифитотийные годы урожай желтого люпина может снижаться на 90-100%. Частота эпифитотии составляет 2-3 раза в 5 лет. Антракноз – одна из причин уменьшения посевных площадей люпина во всех люпиносеющих странах мира.

Принцип метода: выделение патогена из пораженной ткани в чистую культуру, визуальное определение поражения возбудителемсемян и вегетирующих в поле растений. 

Симптомы проявления болезни

Антракноз поражает все культурные виды люпина, но наиболее восприимчивыми к нему в условиях Нечерноземной зоны России оказались желтый и белый люпины.

На этих видах люпина заболевание проявляется во все фазы его онтогенетического развития. Первые признаки заболевания можно обнаружить на всходах. На семядольных листочках появляются мелкие серо-бурые пятнышки, позднее переходящие в оранжево-бурые некрозы с последующим отмиранием семядоли. При поражении гипокотиля и корневой шейки появляются вдавленные продолговатые пятна или продольные штрихи размером 0,5-1,5 см, покрывающиеся в дальнейшем обильным налетом конидий. Больные всходы отстают в росте и развитии. При сильном развитии болезни на корневой шейке образуются перетяжки, приводящие нередко к гибели растения.

На взрослых растениях болезнь проявляется на стеблях, черешках листьев, цветоносах, цветках и бобах, редко на листьях, на которых обычно с края образуются сероватые, бурые или бежевые пятна с налетом спороношения гриба.

При поражении черешков листьев у их основания образуются сначала бурые пятнышки, которые затем увеличиваются в размерах и углубляются. В результате черешок ломается, лист отмирает и засыхает.

На больных стеблях появляются продолговатые штрихи, со временем переходящие в бурые вдавленные пятна или язвы. При благоприятных условиях (оптимальной температуре и высокой влажности воздуха) на язвах образуются многочисленные ацервулы (конидиальное спороношение гриба), отчего ткань приобретает оранжево-розовый оттенок. Особенно заметны обширные и глубокие язвы антракноза при проникновении патогена во внутреннюю полость стебля, что вызывает частые искривления главного или боковых стеблей с последующим изломом. Значительные повреждения возникают при поражении патогеном репродуктивных органов растений в фазу бутонизации-цветения. При этом нередко наблюдается побурение и засыхание цветков, опадание завязей или образование недоразвитых засохших бобиков.

На сформировавшихся бобах появляются оранжево-бурые вдавленные, постепенно углубляющиеся пятна, покрытые обильным спороношением гриба. Семена в таких бобах сморщиваются, становятся щуплыми и невсхожими. Зараженные семена являются основным источником инфекции в распространении антракноза.

На узколистном люпине симптомы поражения антракнозом в основном наблюдаются в фазы всходов и образования бобов. На других этапах развития растений отмечены лишь единичные случаи поражения черешков и стеблей. На всходах образуется серая водянистая перетяжка на стебле, которая приводит к гибели растений. На бобах симптомы не отличаются от проявления болезни на белом и желтом люпинах.

Морфологические признаки возбудителя болезни

Возбудителем антракноза люпина является несовершенный меланкониевыйгриб Colletotrichum gloеosporioides Penz. (Deuteromycota, Ceolomycetes, Melanсoniales). Этот вид на многих видах тропических, цветочных и овощных растений развивается в анаморфной (конидиальной) и телеоморфной (сумчатой) стадиях. Сумчатая стадия гриба известна как Glomerellacingulata (Ston.) Spauld. etShrenk. В России на люпине гриб развивается только в анаморфной стадии.

При диагностике антракноза люпина следует учитывать, что поражение и выпады всходов, а также пятна на бобах и семенах могут быть вызваны другими возбудителями, в частности Fusarium spp. Поэтому наряду с изучением симптомов заболевания, описанных выше, необходимо выделить патоген и идентифицировать его микроскопированием.

При наличии характерных подушечек в местах поражений их можно легко снять и посмотреть под микроскопом. Конидиальное спороношение имеет вид округлых или почти круглых, эллипсоидальных или продолговатых ацервул (лож), не имеющих щетинок. Ацервулы размером от нескольких десятков до нескольких сот микрон и нередко хорошо заметны невооруженным глазом. Подушечки располагаются на пятнах или язвах разбросано или группами, иногда концентрически; имеют оранжево-розовый или телесный цвет от слизистой массы образующихся в них конидий.

Конидии одноклеточные, бесцветные, цилиндрические, иногда эллипсоидальные, прямые с одним или двумя закругленными концами (рис.1). Размер конидий довольно изменчив (табл. 1) и зависит от условий внешней среды, сорта. Конидии в ложах склеены между собой студенистым веществом (экссудатом) и подсыхая, конидиальная масса образует плотные подушечки на поверхности пораженных органов.

Рис. 1. Конидии возбудителя антракноза

Прорастая при наличии капельножидкой влаги, конидии дают конечные или боковые ростковые трубки. Вскоре после прорастания на ростковых трубках образуются аппрессории ("прикрепительные диски"), которые прикрепляются к поверхности ткани растений с помощью клейкой слизи. По форме они округлые или овальные, иногда неправильной формы; сначала бесцветные, в дальнейшем приобретающие темно-коричневую окраску (рис.2). При контакте с поверхностью растения на нижней стороне аппрессория образуется инфекционный проросток, который перфорирует кутикулу и эпидермис или проникает через устьице в клетки растения, вызывая его заражение. Аппрессории могут переносить длительное высыхание, сохраняя жизнеспособность.

Таблица 1. Характеристика конидий различных изолятов возбудителя антракноза люпина

 

Размер, мкм	Форма	Цвет конидиальной массы	Примечание
5,52-6,8х9,06-20,28 5,3 х14,7 3,8-7,6х8,06-22,5  (ср. 4,8х14,4) 4,6-5,8х13,3-16,0	продолговатые, цилиндрические, на одном конце притупленные цилиндрические, некоторые яйце- видные цилиндрические, иногда эллипсо- идальные, пря- мые с закруглен- ными концами цилиндрические с закругленными концами	розовые розовые от светло-розо- вой до светло- коричневой розовые	по Агаеву,1993 по Саламатовой, Левитину, 1997 по Котовой, Цветковой и др., 1994 по Gondran, 1994

                                 

Рис.2. Прорастание конидий возбудителя антракноза с образованием аппрессориев

Выделение возбудителя в чистую культуру

Возбудитель антракноза люпина легко выделяется в чистую культуру из пораженных стеблей, створок бобов или семян.

С этой целью небольшие кусочки (2-5 мм) пораженной ткани промывают под струей проточной воды 30-40 минут. Затем стерилизуют в 0,5% растворе гипохлорита кальция 3-5 мин с последующим трехкратным ополаскиванием в стерильной (или кипяченой) воде. Пораженные семена стерилизуют в 96%-ном спирте 2 мин или в 0,5%-ном растворе гипохлорита кальция 10-15 мин и промывают стерильной водой не менее трех раз.

В стерильных условиях кусочки ткани или семена помещают во влажную камеру, для создания которой в чашки Петри помещается стерильная фильтровальная бумага, увлажненная стерильной водой, или раскладывают в чашки Петри на питательные среды. Чашки ставят в термостат при температуре 20-22^оС. После инкубации в течение 5-7 суток вокруг субстрата (кусочков пораженной ткани или семян) образуется мицелий с оранжево-розовым спороношением гриба. С помощью иглы мицелий со спороношением переносится на питательную среду в чашки Петри или пробирки для дальнейшей инкубации при температуре 20-25^oC.

В чистой культуре гриб образует светлый субстратный мицелий. Через 5-7 суток при температуре 20-22^oС на мицелии появляются многочисленные ацервулы с обильным спороношением. Они обычно располагаются концентрическими кругами, иногда беспорядочно по поверхности колонии. К центру колонии ацервулы более многочисленны. При большом количестве образовавшихся подушечек колония приобретает розовато-оранжевый цвет. В ацервулах образуются многочисленные конидии. При определенных условиях, чаще при голодании, в культуре возможно появление микроконидий и хламидоспор. Часто можно наблюдать появление в культуре уплотненных конидиальных масс темно-коричневого цвета, похожих на микросклероции. С возрастом (к 25-30 дню культивирования) колонии гриба приобретают темно-серый цвет.

Гриб растет и дает спороношение на картофельно-глюкозном (КГА), картофельно-сахарозном, кукурузном агарах, среде Чапека и на жидком отваре из семян люпина, гороха или фасоли. Лучшие результаты по скорости роста колоний патогена получены при вынашивании его на КГА, а наибольшее образование конидий наблюдается на жидких отварах, что делает их наиболее выгодными для накопления инфекционного начала гриба.

Картофельно-глюкозный (сахарозный) агар (КГА):

200 г очищенного картофеля

20 г глюкозы или сахарозы

15-20 г агара

1000 мл воды

Нарезанный картофель кипятят в 1 л воды на водяной бане в течение 1 часа. После фильтрования жидкость доводят до первоначального объема, добавляют глюкозу и агар. Стерилизуют 30 мин при 0,5 атм.

Отвары из семян люпина, гороха или фасоли

Семена в количестве 10 штук помещают в колбы и заливают 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют при 1 атм 30 мин.

Во все агаризованные среды перед разливом в чашки Петри в целях подавления развития бактерий необходимо добавлять антибиотики (сульфат стрептомицина, 50 мг/л).

Фитопатологическая экспертиза семян

Фитоэкспертизу семян предлагается проводить методом помещения последних во влажную камеру или на питательную среду. Из средней пробы, предназначенной для анализа, выделяют навеску. Из семян основной культуры отбирают четыре рабочих пробы по 50 штук (ГОСТ Р 50459-92). Для определения наружной инфекции семена не требуют стерилизации, в то время как для обнаружения внутренней инфекции она необходима. Семенной материал дезинфицируют 1%-ным раствором марганцовокислого калия в течение 15-20 минут или 0,5%-ным раствором гипохлорита натрия в течение 15 мин. После обработки их промывают 5-6 раз стерильной водой.

Для проращивания во влажной камере применяют чашки Петри или Коха. На дно чашек помещают кружки стерильной фильтровальной бумаги в два слоя, положенные на гигроскопическую вату толщиной слоя 0,25 см. Продезинфицированные семена раскладывают на увлажненную фильтровальную бумагу в чашки по 10 штук в каждую чашку и проращивают при температуре 20-22^oС. Просмотр проводят на 9-е сутки.

Для количественного учета развития антракноза на проростках предложена следующая шкала:

0 - поражение отсутствует;

1- небольшие светло-коричневые пятнышки на семядолях, штрихи на подсемядольном колене или корневой шейке;

2 - на семядолях оранжево-бурые язвы, приводящие к засыханию семядолей, пятна на подсемядольном колене или корневой шейке, занимающие до 1/3 окружности стебля;

3 - на подсемядольном колене или корневой шейке пятна с разрывом, охватывающие до 2/3 окружности стебля, побурение корешка;

4 - некроз охватывает весь стебель проростка, образуется перетяжка, полное побурение и засыхание корешка, мацерация и гибель проростка.

На питательных средах проращивание семян проводят при необходимости уточнения результатов, полученных во влажной камере, а также с целью выявления внутренней инфекции семян. Микроскопический анализ образовавшихся колоний грибов проводят на 9-10 сутки. Используют общепринятые среды.

Полевой учет распространенности и развития болезни

Полевые учеты проводят в динамике по фазам развития люпина. Основным источником инфекции антракноза являются семена, поэтому первые симптомы заболевания надо учитывать уже на всходах.

По полным всходам обследование проводят с обеих длинных сторон поля в 20 местах на одинаковом расстоянии друг от друга по диагоналям. Осматривают по 10-15 растений, так чтобы общее количество составляло 200-300 растений. Оценку проводят по следующей шкале:

0 - поражение отсутствует;

1 - на семядолях всходов светло-коричневые пятна или штрихи на подсемядольном колене, пятнышки на семядолях занимают до 10% поверхности;

2 - на семядолях бурые некрозы, занимающие до 25% поверхности или пятна на подсемядольном колене и корневой шейке, охватывающие до 1/3 окружности стебля;

3 - на корневой шейке или подсемядольном колене язвы с разрывом до 2/3 окружности стебля, на семядолях побурение охватывает более 50% поверхности;

4 - язва охватывает всю окружность стебля растения, образуя перетяжку; полная гибель всходов.

В послевсходовый период на взрослых растениях учеты проводят в фазы бутонизации - цветения и сизого боба (полный налив зерна).

В целях сигнализации о поражении культуры на территории всего района и составления краткосрочного прогноза маршрутные обследования проводят в 2-3-х хозяйствах, типичных для данной зоны. Учет проводят в поле по маршруту в форме буквы W или Х. На площади до 10 га осматривают 150 растений (по 10 растений в 15 местах), на каждые последующие 10 га добавляется 50 растений, на площади 50 га и более анализируется 350 растений. Для определения достоверного развития болезни на посевах люпина в районе необходимо обследовать не менее 10% от посевной площади культуры. Наблюдения и учеты проводят систематически в течение всего вегетационного периода, не реже чем через 15-20 дней. На стационарной площадке просматривается 20-30 растений на 2-х смежных рядках в трех местах.

Учет поражения вегетирующих растений проводят по модифицированным шкалам, используемых для антракнозов на бобовых.

0 - признаки поражения отсутствуют;

1 - изломы черешков листьев, на изломах оранжево-бурые некрозы; поражение боковых побегов от оранжево-бурых пятен до язв, в месте расположения которых побеги искривляются или изламываются. Количество пораженных побегов не более 2-х.

2 - поверхностные поражения (штрихи или пятна) на главном стебле; поражение (см. балл 1) более 2-х боковых побегов;

3 - глубокие некротические язвы на главном стебле, сопровождающиеся искривлением;

4 - излом главного стебля из-за глубокой язвы, гибель репродуктивной части растения.

Учет развития и распространенности антракноза на бобах проводят в фазу сизого боба, когда на створках хорошо различимы симптомы заболевания, по следующей шкале:

0 - симптомы отсутствуют;

1 - редкие пятна, занимающие до 25% поверхности боба;

2 - пятна переходят в неглубокие язвы, занимающие до 50% поверхности; 

3 - язвы занимают до 75% поверхности створок, происходит сильное поражение семян;

4 - бобы не завязались или недоразвиты, семена, как правило, не образуются.

По результатам учетов проводят расчет процента распространенности и развития заболевания по общепринятым формулам:

Р = n_*100/N, где Р – распространенность болезни, %; n – количество больных растений, шт.; N – количество учетных растений, шт.

R = ?(a_*b)100/N_*K, где R – развитие болезни, %; ?(a_*b) – сумма произведений числа растений или бобов (а) на соответствующий им балл поражения (b); N – общее количество обследованных растений, шт.; К – высший балл шкалы учета.

Для определения средневзвешенного балла развития болезни в хозяйстве, районе, области, крае и т.д. используется следующая формула:

Rc = sR/S, где Rc – средневзвешенный балл развития болезни, %; sR – сумма произведений площади полей (s) на соответствующее развитие болезни (R); S – вся обследованная площадь в хозяйстве, га.

Оценка вредоносности антракноза

Для установления вредоносности на полях выделяются стационарные площадки, расположенные равномерно по полю. На этих площадках этикетируется не менее 200 растений (для каждого балла поражения не менее 50 растений) и ведется систематическое наблюдение за развитием болезни. Затем растения убирают с каждой делянки и в лабораторных условиях распределяют в группы в зависимости от балла поражения. Урожайность каждой группы учитывают отдельно. Определяют полный урожай зерна и зеленой массы, количество бобов на здоровых и больных растениях, в различной степени пораженных заболеванием.

Потери урожая учитываются для каждого балла поражения в отдельности по формуле:

П = 100(Уз-Уб)/Уз,

где П – потери урожая, %; Уз – урожай со здоровых растений, г, кг, ц, т; Уб – урожай с больных растений, г, кг, ц, т.

Коэффициент вредоносности выражает потери урожая, приходящиеся на каждый балл (процент) развития болезни:

К = П/Р, где К – коэффициент вредоносности; П – потери урожая при соответствующих распространенности или развитии болезни, %; Р – развитие болезни, %.

Коэффициент вредоносности позволяет установить относительные размеры потерь и прогнозировать вред от болезни.Для иллюстрации расчета представлены коэффициенты вредоносности, рассчитанные по экспериментальным данным за три года для каждого балла развития болезни, фиксированную в фазу бутонизации- цветения (таблица 2). 

Таблица 2. Коэффициенты вредоносности антракноза на желтом люпине 

Балл (процент) развития болезни	Коэффициенты вредоносности
	По зеленой массе		по семенам
1(25%) 2(50%) 3(75%) 4(100%)		0,46 0,71 0,73 0,80	0,37 0,63 0,69 0,96

Чтобы получить представление о размере вреда, наносимого антракнозом, в определенной зоне, необходимо иметь средние многолетние данные по площадям посевов, имеющих слабую пораженность (% развития болезни от 1 до 25),среднюю пораженность (26-50%) и сильную пораженность(более 50%), рассчитать средневзвешенный балл поражения и определить соответствующий ему средневзвешенный процент потерь урожая.